植物miRNA潜伏人体公案

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: N1 k! Q( |3 ^& Z8 UMicroRNA （miRNA），顾名思义，个头很小，只有约19～24个核苷酸，又名微小RNA或小分子RNA；近年人们发现它不是植物的专属，动物体内也有。简言之，miRNA广泛存在于真核生物体内。

% b; m9 u. G) S科学家发现miRNA并不是很久之前的事情。1993年，哈佛大学的罗莎琳德?李（Rosalind Lee）等人首次发现miRNA对于生物体基因表达的调节作用。此后，研究人员陆续发现miRNA具备诸多基因调控功能。2002年，美国《科学》杂志把miRNA的研究成果评为当年的“年度重大突破”。自此，miRNA名声大噪。

# R# a3 h' P0 h* h不过，学界一直认为miRNA只是自产自销的非编码RNA，不能跨物种发挥作用。然而，南京大学生命科学学院教授张辰宇的一项研究成果改变了这一切。

2011年，张辰宇团队在Cell Research（由中科院上海生科院主办，并与英国自然出版集团合作出版，以下简称CR）杂志上发表论文称，稻米中一种含量丰富的植物miRNA（MIR168a）在人体的血清里大量存在。意即，向来井水不犯河水的植物miRNA可以通过日常饮食进入人体血液和组织器官，甚至参与调控人体相关的基因表达。
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6 O, D& v- X2 J4 U' W# t这一发现非同小可。它不仅打破了业界关于miRNA不跨界调控的传统认识，更触发了人们对正反两面效应的憧憬和担忧：miRNA可能是诊疗疾病、营养健康的新方向，也可能会对人体基因表达带来潜在危害。
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这对于RNA研究领域而言，不啻于一场地震。
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/ D6 x, F% ?/ I3 e6 u2 j很自然地，该研究成果一经公开发表，业内的质疑、圈外的误读也纷至沓来。加之其中阴差阳错的学术纷争，国际科学界围绕“植物miRNA是否潜伏人体”展开了针锋相对的争论，一来二去，竟成了一桩科学公案。

8 {! J, Y( w* s* _# D记者先后寻访了南京大学教授张辰宇、Cell Research杂志常务副主编李党生、中国农业大学食品科学与营养工程学院院长罗云波、中国科学技术大学生命科学学院教授单革、华中科技大学生命科学与技术学院教授薛宇等人，试图还原“miRNA公案”的台前幕后。
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$ q- [2 h6 M- u颠覆发现
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张辰宇这一惊世发现是“妙手偶得之”吗？这要从2007年说起。

2 ^2 p3 M$ z# s7 A1 ^0 O2007年的一天，张辰宇给还在南京大学读博的陈熹布置了一个实验，让他去检测人的血清中是否含有miRNA。陈熹当时认为导师疯了，因为这完全违背他所学的生物学常识：人的血清中含有许多RNAse（核糖核酸酶，主要功能为水解RNA），RNA不可能稳定存在于人血液中，至多只是一些碎片。
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$ `5 G# q2 J$ D/ e当他在导师要求下真的把实验做起来之后，他比张辰宇还“疯”：三天三夜泡在实验室里，只因为得到的结果令他“难以置信”。
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随后张辰宇团队在CR上报道了他们的发现：人和动物自身内源性miRNA可以稳定地存在于富含RNAse的血清、血浆等体液中（包括牛奶和各种乳液），这颠覆了细胞外RNA不稳定的生物学概念。张辰宇对记者说，这是他们“颠覆”的开始和此后发现“最根本的基础”。

几乎同时，他们发现有部分人和动物血清、血浆中的miRNA是细胞主动分泌出来的。2010年，张辰宇团队又报告了细胞分泌的动物内源性miRNA，以低浓度在血清、血浆中被转运至靶细胞和靶组织，发挥生物学功能，从而介导了细胞间的信号传递。
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张辰宇说，这一发现也颠覆了siRNA/miRNA在体内必须以人工设计的运输系统，运送高浓度、大剂量的siRNA/miRNA到靶细胞和靶组织，才能发挥作用的现有概念。同时提示了内源性分泌型miRNA可在“极低”浓度被运送至靶细胞和靶组织，发挥生物学功能。

) t% ~* M1 |8 f8 a" W在miRNA研究的背后，张辰宇团队也感受到了压力。2008年初在他们作出循环miRNA的文章并向《自然》投稿的过程中，就有其他研究组关于“血浆中含有循环miRNA”的文章在《美国科学院院报》（PNAS）上发表，同年9月张辰宇团队的文章转投CR发表；而他们另一篇关于miRNA调控的文章，投向《科学》杂志也送了审，但根据意见，估计半年多才能完成，当时他们马上改投其他杂志发表后，不多久《自然》上就刊发了一篇类似的文章。
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  F# R1 f2 l  Q“做miRNA这种热门方向的压迫感，就是时间不等人。”陈熹感慨说。
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真正在投稿中遇到波折，还是在他们最颠覆的研究发现的成果发表上。
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张辰宇等人开始研究血清miRNA的时候，他们就对血清中miRNA作了深度测序，在他们后续的分析中，惊讶地发现血清中也有植物miRNA的存在，而且有完整的序列和较高的拷贝数。
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! }$ c6 x" X, D, h, K7 U9 X植物miRNA与动物的基因组的序列没有100%的一致序列，因此他们认定动物血清中发现的植物miRNA来自于植物，而非动物内源性miRNA或RNA碎片。
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随后他们发现了约有四五十种外源性植物miRNA在人和动物体内存在，并具有与内源性动物自身miRNA一样的较高浓度。他们很快开始着手设计实验，研究植物miRNA如何进入人体、是否发挥调控功能等。

4位博士同时做相关的实验。一年半的实验后，他们开始给《细胞》、《自然》、《科学》（业内简称CNS）投稿，其间先后的修回补足实验就花了1年零2个月的时间，距离第一次投稿约2年后他们放弃CNS，2011年张辰宇转投CR。
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) _6 c9 U: f/ G, Y, `+ j; L遭遇质疑

* @! f2 |+ `' \/ U4 n! @4 [! Q出乎意料地，这篇文章2011年8月11日投稿，8月23日按意见修回，8月26日就得到发表，前后一共15天。

( I' X6 O$ k4 Z# H3 H. |$ ^: F谈及CR对张辰宇团队关于“植物miRNA能够进入人体跨界调控”研究成果的快速发表，CR常务副主编李党生对记者解释道：“我们看到张教授的文章无论从新颖性到数据的严密性都非常好，最后一轮审稿人的意见我们也看到了，他们的评论对数据没有进一步的批评意见，即对数据是认可的——这也佐证了我们的看法。当然，我们也请了领域内专家进行了同行评审，对提出的一些建议经修改后，我们就决定发表。”
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原来，CNS不但认真评审了张辰宇团队的论文，而且对论文的数据也并没有给出进一步的批评意见，只是他们觉得该成果“Hard to believe”（难以置信）。

+ p! |5 R5 K3 T要怎样才肯相信呢？“CNS要求我们把整个miRNA是怎么被吸收进去的机理全部搞清楚才相信。”张辰宇苦笑道，“要真能搞清楚，我们就获得诺贝尔奖了。”

9 U9 }- T! P2 s5 Q李党生和薛宇都认为，这个要求对于突破性成果的第一篇文章，从科学上讲有些“过分要求”了。

CR考虑到这篇文章可能引起强烈反响，还专门举行了新闻发布会。

  s5 x  x' e' o3 J/ g" C: `6 a发表在CR上的这篇文章，张辰宇团队报告了食物中某些外源性植物miRNA可以被动物的胃肠上皮细胞主动吸收，并能和内源性分泌型的动物miRNA一样，被分泌到循环系统内，在“极低”浓度被运送至靶细胞和靶组织，“跨界”调控动物的基因表达，发挥生物学功能。

他们对编号为MIR168a的微小RNA的小鼠实验研究中，发现进食大米的小鼠体内MIR168a含量的确升高，并影响了小鼠LDL的调节。这指向植物RNA能够进入动物体内并影响动物的生理调节。

报告一出，他们的成果很快引起国际科学界热议，Google学术搜索提示该论文已有151次引用（截至2013年11月25日）。多家国内外媒体纷纷报道，质疑声也随之而来。
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% ?) V  h3 f6 ]  b先后有两篇论文反驳张辰宇的研究结论。2012年8月8日BMC Genomics发表了孟山都公司的一篇论文，其研究结果宣称，在动物体内发现的植物miRNA可能来源于测序操作中的污染。

对于该文章，张辰宇认为此文的结论“太草率了”，鲜有人关注——的确，截至11月25日，其引用次数仅有12次。
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随后，2013年7月RNA Biolog一篇研究也以重复张辰宇团队的实验的方法，对其研究结论进行了质疑。

来自约翰斯?霍普金斯医学院的助理教授肯?维特威尔（Ken Witwer）以尾纤猕猴为研究对象进行了类似研究。他给猕猴喂食豆类制品的冰沙，并对猕猴进食前后的血液分别进行植物miRNA（0，1，4，12小时）分析后发现，一些植物miRNA低水平扩增观察到了，但这个结果高度可变：有时小分子RNA在低浓度存在，有时完全没有。
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. Z1 d6 x9 t& K& c" U  e也就是说，该文试图重复张辰宇团队的研究结果，而结果是重复性“不可预测”。

9 U* ~% E8 [. k张辰宇认为此研究的实验技术还有待改进，可能是导致结果未能重复的原因。此外，Google学术搜素显示截至11月25日该文仅有1次引用。
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“这些研究组作了有益的探索。但是对我们来说，论文发表2年后，才有几篇相关的后续研究发表，太少了。”张辰宇向记者表示，对于那些读了论文、对他们的结果不信服，未能重复而质疑的研究者，或只是由于结论的“extraordinary”（非同寻常）而不相信结果的研究组或个人，“我所有的同事和学生都恨不得提供一切可能的条件和信息让他们重复或证明并拓展该领域。”
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争鸣

2013年11月8日，《Nature Biotechnology》（自然—生物技术，下简称NBT）杂志在线发表了由miRagen Therapeutics公司（美国一家研发miRNA疗法的企业）和孟山都联合完成的重复张辰宇团队实验的论文，结论与之大相径庭：在实验动物体内测出的植物miRNA的读段数显著小于张辰宇团队的论文中的数字。
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2 r7 D! E% t/ t: r+ ^6 T该论文再度得出阳性结果可能是污染、测序方法验证不出动物血清里的植物miRNA等结论。为此，NBT专门配发了一篇编者按（Editorial），对刊发该“负结果”论文进行了说明，由此引发了双方的争论。

) j8 y4 H1 O2 Z! X- S# F/ Y. k1 r" rNBT：

  c& b; O2 Z, }# U* d“……由miRagen Therapeutics和Monsanto合作的这篇新的研究报告指正了以前在Cell Research（22, 107—126, 2012）上发表的争议性研究成果。这项在中国南京大学张辰宇教授的指导下进行并在Cell Research（22, 273—274, 2012）上发表了原文勘误的研究成果发表后引发了激烈的辩论，因为其报道了在人体血浆中存在植物来源的microRNA（miRNA），并指出通过饲喂小鼠大米使得植物来源的miRNA168a在进入小鼠的循环系统之后能够靶向调节其靶基因。”
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* X# F- g- {" a“在本刊第965页刊登的结果却与此恰恰相反。除了没有在食用大米后的老鼠的血浆和肝脏中检测到miRNA168a之外，他们目前的酶联免疫吸附实验的数据也与张教授文章中的在小鼠中miRNA168a能够直接抑制低密度脂蛋白受体衔接蛋白1（LDLRAP1）的表达水平的免疫印迹结果相冲突。最后，miRagen公司的研究表明了在小鼠血浆中低密度脂蛋白的变化主要是由饮食结构的差异引起的，而不是miRNA介导的跨界调控。”
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. B# Y  M  @) _  v" s0 m“……事实上在去年的3月，一篇发表在Environment International（55, 43—55, 2013）上的文章已声称利用基因沉默技术改造植物基因将引起人体健康的问题，并且这方面内容并没有被现有食品安全评估体系考虑在内。”
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9 W) b7 h' e3 A$ K3 W“当初始的研究报告引发如此程度的关注，并令研究人员以及监管评估机构投入大量的时间、精力、资源去评估其调查结果和理解其含义时，重复性的研究成果无疑是值得发表的。很可惜它并没能发表在Cell Research上而使得该文不能与最初的那篇论文衔接上。”
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（摘自NBT《Editorial：Receptive to replication》）

张辰宇：

“我们毫不反对其他科研同仁对我们的实验结果进行重复。事实上，我们十分欢迎全体相关研究人员来验证我们的结果，因为我们坚信植物miRNA对于动物的跨界调控是一项非凡的发现，并且“对于食物来源miRNA的吸收程度以及跨界基因调控的潜力的审慎评估方面的后续研究也势在必行”。为吸引其他科研同行投入到相同领域中来，我们和全世界范围内的众多实验室建立了紧密的合作。我们还派出了研究人员去其他实验室进行示范，如德州休斯顿市Baylor医学院的Kendal D Hirschi实验室。”

“表面上，该编者按只是在‘教训’CR应该如何对待以‘阴性结果’为主的稿件，但实际上想要误导读者得出孟山都和miRagen共同支持Marshall组的重复我们前期研究的‘阴性结果’是正确的。此误导手法体现在：整篇文章竟然对我们指出该研究组因实验技术水平和对结果的错误分析而导致的‘阴性结果’并同期发表的回复（reply）只字不提；对该读者来信所用的具体实验技术等也不置一文，只是用大量笔墨泛泛论证为何Marshall研究小组的读者来信因其‘阴性结果引发出了一个关键性的科研问题’而理应发表，并盛赞孟山都和miRagen公司不避讳发表阴性结果的行为是‘大公无私’。”

“如同我们在‘回复’中仔细说明的内容一样，我们指出了Marshall研究小组存在3项导致其无法重复出我们的结果的主要研究缺陷（miRNA测序读数过低、qRT-PCR中内参不好、样本数量太小）。然而，这篇编者按仍然有意无视我们的‘回复’，误导读者认为我们的结果是无法重复的……”
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（摘自张辰宇尚未公开发表的《Receptive to replication or interest？》）