Nature：生命时钟的校对者

小丫 · 发表于 2014-6-26 22:57:43

Steve Horvath小时候在德国长大，在他十几岁的时候，他和他的双胞胎兄弟 Markus，以及他们的好朋友 J?rg  Zimmermann一起成立了一个叫做吉尔伽美什的小组（the Gilgamesh  project），他们会定期聚会，讨论数学、物理和哲学问题。吉尔伽美什在目前世界已知最古老的叙事诗《吉尔伽美什史诗》中，是苏美尔（Sumer）王朝时统治着古代美索不达米亚（Mesopotamia）地区的都市国家乌鲁克（Uruk）的国王，他十分想找到一种能够让他永葆青春的灵药。据  Horvath介绍，他们之所以想到用吉尔伽美什这个名字就是受了这个故事的启发。所以他们的讨论会往往都会跑题，去讨论如何延长生命的问题。
他们的最后一次讨论是在1989年，他们三人在这次会上郑重表示，这辈子都要投身到延长人类寿命的科学工作当中。J?rg选择了计算机科学和人工智能科学作为他的专业，  Markus选择了生物化学和遗传学，Steve则表示，他打算利用数学模型和基因网络来研究如何延长人类的寿命。J?rg后来真的成为了德国波恩大学（University  of Bonn in Germany）的一名计算科学家，专门从事人工智能方面的研究工作，可是Markus却中途“溜号”了，他最后成为了一名精神科医生。
Steve现在是美国加州大学洛杉矶分校（University of California, Los Angeles,  UCLA）的一名人类遗传学家，同时也是一名生物统计学家，他总算是实现了自己当初立下的诺言，他对此也感到非常欣慰。Steve一个人经过多年辛苦的工作，还经历过论文屡次被拒，并且痛失了一名爱女的痛苦过程，最终完成了对超过1.3万份人体组织标本数据的分析和整理工作。他发现了一台细胞生物钟（cellular  biological  clock），这台生物钟以其走时准确、简洁易读，而且与人体很多部位都高度同步（只有少数例外，这些例外却为我们提供了宝贵的线索，有助于我们了解衰老和疾病的本质）的特性震惊了全世界的同行们。
Horvath这台生物钟的计时原理主要来自表观遗传学，这是一种在不改变DNA序列的前提下，通过各种化学基团和结构修饰作用，对基因的表达产生影响的作用机制，而且这种作用还可以随着细胞的分裂“遗传”下去。随着细胞的衰老，表观遗传学的修饰也会发生改变，其中某些变化就可以当作计时的依据。为了判断一个人的年龄，Horvath对DNA中数百个散在分布的位点进行了分析，他重点关注这些位点的甲基化修饰情况，即在DNA链上是否连接了甲基基团（methyl  group）。
Horvath还为此专门开发了一套算法，根据这些位点的甲基化修饰情况估算整个人体（而不是细胞）的年龄。让我们以白细胞为例，我们都知道白细胞的寿命通常都只有几天至数周，可是这些细胞却可以携带它们来源身体50年的信息，出入只有几年而已。口腔粘膜拭子、脑组织、结肠组织和各种其它组织和器官来源的DNA都可以进行这种分析。这是独立于生物标志物（biomarker）之外的另外一套年龄计算方法，但是使用生物标志物存在组织来源的限制，只有一两个组织的生物标志物可以被用于估算年龄，比如被当作金标准的门冬氨酸外消旋法（aspartic  acid racemization）就只能够对牙齿或骨骼里的蛋白质进行分析。
“我希望开发一种适用于绝大多数组织的方法。当然这也是个非常冒险的想法。”  Horvath介绍道。不过现在看来他是赌赢了。他的研究成果在去年得以发表，到他发表的时候，他的生物钟的误差已经缩小到了3.6年，即43个月。而且这个数字是针对大部分组织而言的，如果具体到某一个组织的标本，准确度会更高，比如唾液标本是2.7年，某些白细胞标本时1.9年，大脑皮质标本是1.5年等等。用这种方法对刚刚取自胚胎的干细胞进行分析，得到的结果是非常年轻；而对百岁老人的脑组织进行分析，得到的结果就是100岁左右。
美国加州大学旧金山分校（University of California, San Francisco）的Elizabeth  Blackburn曾经因为对端粒（telomeres，这是一种位于染色体末端的结构，会随着年龄的增长而不断的缩短）的研究而获得诺贝尔奖。她表示，年龄与表观遗传学之间具有如此密切的联系，这表明，在细胞里一定有一些东西是永恒不变的。这些东西可能就是我们探索生物未知奥秘的线索。如果某个人的实际年龄和用这种方法推算出来的年龄不一致，那么可能也说明他的身体存在一定的问题。
就在Horvath的论文发表几个月之后，其他的科学家们也都纷纷重复出了他的研究结果。这一下子引起了轰动，大家都在讨论这项技术的潜在应用价值，不过也有人在探讨该方法背后的生物学机制。
澳大利亚昆士兰大学定量遗传学系（quantitative genetics at the University of Queensland in  Australia）的主任Peter Visscher就表示，这的确是个新东西。如果  Horvath的发现是确认无误的，那这就是一个非常有趣，而且非常重要的重大发现。
校准
Horvath一直都坚守着当初立下的吉尔伽美什誓言，他拿下了生物统计学博士学位，并且于2000年在加州大学洛杉矶分校遗传系得到了一个职位，后来在2006年时获得了长期教职的职位。之后他开始专注于衰老问题，他关注的重点是基因活性（gene  activity）在人这一生中的变化情况。他的一名博士生负责具体的工作，将基因转录数据输入一套统计软件，希望找出与衰老相关的有效生物标志物（biomarker）。可是他俩干了一年多，还是一无所获。最后他们得出了一个结论，认为如果在基因转录数据中真的存在这种与衰老生物标志物有关的线索，也是难以被发现的，因为这些微弱的线索会被人与人之间，以及器官与器官之间的差异（也就是数据的背景噪声）给掩盖掉。于是Horvath决定不再让他的学生和博士后干这项没有前途的工作，“拿他们的学业和职业生涯来冒险，这对他们是非常不公平的。”  Horvath这样解释道。
可是在 2011年时出现了转机。当时 Horvath参与了他们学校另外一名同事Eric  Vilain的科研项目，Horvath在其中的工作主要是对从68名成年人唾液标本中提取出来的  DNA样品的甲基化修饰情况进行分析。他们希望找出与性别相关的表观遗传学修饰模式（epigenetic  pattern），可最终没能成功。但是Horvath可不想浪费这些数据，他想看看这些数据是否与衰老有关。
在人类的DNA链上，甲基基团主要都连接在CpG位点上。通常来说，在一个人的基因组中大约有2800万个CpG位点。但是使用微阵列技术（microarray  technology）进行样品甲基化修饰情况的检测只能发现其中的很少一部分位点，使用老式仪器大约可以发现2.7万个位点，使用最新仪器也只能发现48.5万个位点。
不过Horvath是幸运的，他成功建立了一个非常简单的统计模型，只需要对DNA样品中的两个CpG位点进行检测，然后统计出一滴唾液里有多少个细胞在这两个CpG位点上发生了甲基化修饰就足够了。这样得出来的结果与个体年龄的相关性高达85%，平均误差在5年左右。
Horvath经过后续的工作又发现，以脑组织细胞和血细胞等多个其它组织的细胞为标本，获得的结果更加精确。突然之间，他最开始绞尽脑汁希望发现的与衰老相关的生物标志物似乎就要唾手可得了。
但事情可没那么顺利。他还必须将大量既包含个体年龄，又包含个体DNA甲基化修饰信息的数据库给整合起来。在各种医学研究工作（但一般都不包括衰老研究）中都会用到甲基化修饰信息（Nature  508, 22;2014）。由于每个人在样品采集，以及样品处理等工作中采用的方法或工作习惯都会有所差异，因此很难对各个工作所取得的数据进行平行比对。  Horvath对此就非常担心，他说道：“各个实验室使用不同的实验流程得出的实验结论怎么能够放到一起进行比较呢？”
不过Horvath最终还是以英国伦敦大学学院（University College London）Andrew  Teschendorff的工作为基础，找到了一种校准方法，得以对不同的甲基化修饰数据进行比对。除此之外，他还采取了一种非常大胆的方法，就是直接忽略不确定的部分，他认为这种忽略不会影响到最终结果的精确性。
结果发现他又赌赢了。在 2012年初，  Horvath使用他的新算法（对基因组中的16个CpG位点进行检测）对9种不同的人体组织进行了研究，结果发现与年龄的相关性高达96%。而且准确度得到了进一步的提升，在使用血细胞为样本时误差在3年左右，而使用口腔黏膜拭子为样本时误差只有18个月左右。
但还是有两本杂志的编辑对Horvath的文章做出了拒稿处理。据Horvath介绍，这些编辑的拒稿理由是“这个工作的结果太完美了，他们不敢相信。”这些编辑认为，Horvath的算法对于他所使用的数据也许非常合适，但是他们认为Horvath还应该用更多的数据对这套算法进行更彻底的检验。
于是Horvath继续收集数据，继续完善他的算法。到了2012年底（12月），他的数据库里已经收录了51种非常见的组织和细胞，以及20种肿瘤组织和细胞的数据。他检测的  CpG位点的数量也增加到了353个。
完成这些工作之后，Horvath决定从头开始重新撰写论文，可是这时他的妻子出现了早产的迹象，羊水破了，比预产期整整提前了3个多月。在接下来的20多天里，他的妻子和医护人员们一直在与早产和感染搏斗，虽然  Horvath也在病房里陪伴着他的妻子，可是他几乎就没离开过写字台。
Horvath当时的压力非常大，他回忆说：“我每个小时都在不停地写稿子，每个小时对我来说都好像是最后一个小时一样。”不过他的文章也进展得非常顺利，而且妻子和她肚子里的孩子也都在一天天地恢复。三周之后就快到圣诞节了，“我当时心中感觉充满了希望。”  Horvath这样说道。可是他的孩子却突然出了问题，听不到胎心了。于是医院立即实施了紧急剖宫产手术，终于把孩子给抢救了过来。Horvath感慨道：“医生们非常了不起。可是我的女儿还是没能挺过出生后的第一天。不到10天之后，我就把文章投给了《基因组生物学》（Genome  Biology）杂志。”
到第二年开春的时候，编辑给我回信了，可是这一次他们居然还是做出了拒稿的决定。理由还是他的结果太好了，不太敢相信。  Horvath也能够理解这一点，他介绍道：“每一个寻找生物标志物的科研人员都清楚，哪怕是非常相关的生物标志物，相关系数也就在
0.6~0.7之间。比如年龄与端粒长度的相关系数只有不到0.5。”可是Horvath开发的这套算法得出来的相关系数却高达0.96。Horvath也承认，最开始他自己对这个结果都不太敢相信，直到其他人也独立地得到了相同的结果，他才敢最终确认。
但是这一次Horvath决定不能就这么算了。他说道：“我拿到了编辑的回信之后，花了10分钟做了三件别人都不会做的事情。第一件事就是，我跑到冰箱里拿出三瓶啤酒，一口气全喝光了。第二件事就是，我打开电脑给编辑写了一封回信。第三件事就是，我马上点了‘发送’键。”
与时间有关的问题
这次“上诉”居然成功了，他的文章也最终于2013年的10月发表在了《基因组生物学》（Genome  Biology）杂志上，也开始有人到Horvath的网站上下载他开发的表观遗传学生物钟算法软件。荷兰乌德勒支大学医学中心（University Medical  Centre Utrecht in the Netherlands）的Marco  Boks也使用这套软件对他采集的96份荷兰退伍军人的血样进行了分析，这些退伍军人都曾经参加过阿富汗战争，年龄在18至53岁之间。结果发现计算出来的年龄与每个人的实际年龄之间的相关度高达99.7%，而且平均误差只有几个月。
美国加利福尼亚州尔湾市 Zymo Research生物技术公司的Wei Guo和Kevin  Bryant则很想知道这套软件是否可以用来分析尿样。Zymo公司之前收集了11份尿样，这些人的年龄在28岁至72岁之间，男女都有。结果得到的相关系数也高达98%，标准误差在
2.7年左右。Bryant评价道：“这个尿液分析的结果太棒了，要知道Steve在开发这套算法时根本就没拿尿样做过测试。”
Horvath开发的这套软件可以应用在很多方面。比如在罪案调查工作中，可以使用这种技术，根据遗留在现场的少许生物样本推测出嫌疑人或受害人的年龄。Trey  Ideker是美国加州大学圣地亚哥分校医学遗传学系（the medical-genetics division at the University of  California, San  Diego）的主任，据他介绍，他们系也开发过一个专门用于血液样本的表观遗传学生物钟技术，他们正与一个法医实验室合作，想通过数学的方法来看看他们的这套表观遗传学生物钟技术是否与Horvath的是一样的。虽然Ideker的生物钟只能够使用血液样品，而且准确度也没那么高，但是使用成本也相对较低，他们只需要检测71个CpG位点就可以了，而不是Horvath那样需要检测353个位点。
Ideker和Horvath都认为，这套生物钟最有意思的应用应该还是用来发现“加速老化（age  acceleration）”，即一个人的表观遗传学年龄与实际年龄不匹配的情况，而且既可以是整个人的加速老化，也可以是某个器官的加速老化。
及早发现这种不匹配现象就可以让我们及时警觉。美国国家心脏、肺和血液研究所（US National Heart, Lung, and Blood  Institute, NHLBI）的Brian  Chen与Horvath等人对他们收集的2100多份年龄在40岁至92岁之间的中老年人（包括男性和女性，这些人都是参加了Framingham心脏病研究的志愿者）的甲基化修饰数据进行了分析，并在去年11月召开的美国老年学会（Gerontological  Society of  America）会议上报告了他们的分析结果。他们发现，老化加速每增加5年，全因死亡率将会增加15%。据Horvath介绍，其他两个大型研究尚未发表的数据也显示，表观遗传学年龄大于实际年龄是一个死亡的独立危险因素。
科研人员对来自同一个体，各个不同组织的年龄也进行了比较，他们希望能够发现更加准确、而且侵入性更低的诊断方法，用于疾病诊断，或者评估患病风险。就在去年，Ideker等人报道，乳腺癌、肾癌、肺癌和皮肤癌组织的表观遗传学年龄要比患者自身的表观遗传学年龄老40%。不过使用Horvath的方法并不能得出这么清晰的结论。有些肿瘤，比如脑癌组织会老上几十岁。但是某些肿瘤，比如某些类型的子宫内膜癌或乳腺癌却又不是这样的。
这种表观遗传学年龄与实际年龄不一致的现象似乎与其它疾病的关系更加紧密。据  Horvath介绍，最近的一些工作已经发现，体内能够检出HIV病毒复制的感染者，与体内病毒复制被抑制的感染者或健康人相比，前者也会更“老”一些。另外一个尚未发表的研究也观察到，在过度肥胖的人群中，有一些组织也呈现出非常明显的加速老化现象。Horvath计划在接下来的几个月里，深入挖掘妇女健康项目数据库（Women’s  Health Initiative  database）以找到更多的证据。妇女健康项目是NHLBI开展的一个历时20年，涉及16万人的大型研究项目，这个数据库里也收录了数万个甲基化数据信息。
年龄问题
医学研究者们也许不清楚这套表观遗传学生物钟的工作原理，但是他们可以利用这套技术更好地开展临床诊断，进行疾病分型和鉴别。但是Horvath可不希望就此打住。他说道：“最大的问题是，这套生物钟显示的‘时间’是否与某个特定的生物学进程及目的有关。”他认为这个生物钟最有可能与表观遗传学持家基因系统的功能相关，这套基因的作用就是通过甲基化修饰作用来维持基因组的稳定性。该系统的功能越活跃，这套生物钟走得就越快。
通常来说，由于甲基化修饰作用都是可逆的，所以Wei认为，如果我们能够想办法抓住表观遗传学生物钟的走针，让它走慢一点，那么也许就能够让Horvath等人在年轻时许下的愿望变成现实。“我们最大的希望就是，这个生物钟显示出来的时间真的能够反映出与衰老进程相关，甚至是直接影响人体衰老的生理进程的进展程度。”
不过也有一些人对这台生物钟持怀疑态度。比如Teschendorff的研究就发现，全基因组的甲基化修饰情况本来就会随着时间而逐渐发生改变。他认为这背后存在着某些被动的过程，而衰老与疾病的主要原因则是干细胞的分化受到了影响。Ideker也认为这种伴随着年龄增长的表观遗传学的变化可能就是随机发生的，也许那353个位点的改变没有任何意义。
Horvath也承认，他们还需要开展更多的工作来明确表观遗传学年龄与实际年龄相比，是否能够更好地反映疾病的发生和衰老的进程。不过他也表示，这台表观遗传学生物钟给我们提供了一个新的起点和新的希望，我们有可能改变衰老的进程。如果真是这样，那吉尔伽美什王的愿望就能够实现了。
原文检索：
W. Wayt Gibbs. Biomarkers and ageing: The clock-watcher. Nature, 8 April  2014; doi:10.1038/508168a

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