探索lncRNA的世界 各路工具来帮忙[选购宝典]

小丫

探索lncRNA的世界，当然需要一定的工具。所幸，lncRNA与mRNA有些相似，故标准的基因表达分析工具（如cDNA制备、定量PCR、芯片、测序）也能派上用场。据专家介绍，唯一需要注意的就是灵敏度。美国Beckman研究所的John Rossi认为，分离和研究lncRNA不需要特殊的工具，但需要方法来检测它们，因为它们通常丰度很低。
lncRNA研究的技术路线可参照mRNA或miRNA：借助芯片来研究差异表达的lncRNA，之后通过qPCR或Northern blot来验证。接下来就是特定lncRNA的功能分析，RNA干扰、过表达等等。
芯片
对于lncRNA的表达谱分析而言，芯片是个强大的工具。目前有多家公司提供lncRNA的芯片和服务，包括Arraystar、Affymetrix、安捷伦等。
美国Arraystar公司自2009年起一直专注于lncRNA芯片的开发，如今已推出第三代产品——Arraystar Human LncRNA Microarray v3.0。其国内代理公司为康成生物，独家提供Arraystar lncRNA芯片技术服务。据介绍，目前康成客户在此方面的研究文章已达11篇，其中3篇发表在著名肝脏疾病杂志《Hepatology》上。
LncRNA芯片让您能够在单张芯片上同时分析lncRNA和mRNA的表达谱。这样，您不仅能够了解差异表达的lncRNA和mRNA，还能清楚它们之间的关联。与传统芯片不同，Arraystar Human LncRNA Microarray v3.0采用了“转录本特异”的探针设计，可准确检测由一条原始转录本来源的不同RNA。此外，v3.0芯片增加两种探针，分别检测带开放阅读框的潜在lncRNA以及转录的假基因。
Arraystar也独创了自己的lncRNA核心数据库，并定期更新。v3.0芯片正是充分利用了该数据库的最新信息，让您能够通过这款芯片产品获得更全面、更权威的lncRNA数据。了解更多
! c. P6 @8 N" V1 b老牌的生物芯片公司Affymetrix最新推出的GeneChip? Human Transcriptome Array 2.0（HTA2.0）基因表达芯片，覆盖8个权威数据库，可以同时检测mRNA和lncRNA，包括245,349个编码转录本和40,914个非编码转录本。HTA2.0芯片是一款全转录组芯片，即可以在全转录组水平分析基因表达变化（包括基因水平和外显子水平），克服了传统3’IVT表达谱芯片检测信息不完整的弊端。
' q* o3 _+ Q4 Q6 ^$ j传统的3’IVT表达谱芯片通常将探针设计在转录本3’端，无法检测3’端缺失的转录本异构体，也无法检测可变剪切事件的发生。HTA2.0提供了超高密度的芯片设计，总探针数接近700万条，为每个外显子设计了约10条探针，为每个转录本设计超过140条探针，可以提供基因水平分析和外显子水平分析；同时针对可变剪切也设计了近34万条探针，实现了可变剪切的检测分析。
1 l0 W/ F, Z1 V" k$ o6 h通过此芯片检测，您可对目前所有已知的人类lncRNA进行检测，快速获得与特定生物学过程或疾病相关的lncRNA的表达变化，以及在其调控下，mRNA表达的差异。在一张芯片上开展两个水平的研究，可提高研究效率，有助于阐明这些lncRNA的生物学功能以及发现特定疾病的分子标志物。了解HTA2.0的更多信息
安捷伦的SurePrint G3基因表达谱芯片也将编码和非编码RNA整合在单张芯片上，实现了lncRNA 和蛋白编码基因的同步检测。这是安捷伦与 John Rinn 实验室（隶属于麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所）合作的成果。
) I! H' X- B3 E' A- C这款8x60K的芯片在2010年首次推出，如今已升级到第2版，更好地反映了目前对lncRNA表达和结构的了解。2011年秋天，John Rinn 实验室的Moran Cabili及其同事深入研究了来自24个人类组织和细胞系的RNA-seq数据集，并鉴定出近8,200个假定lncRNA，包括4,662个严格的lncRNA。第二版的芯片正是反映了lncRNA目录的更新，同时也包含了新的mRNA探针。
SurePrint G3人类基因表达谱v2芯片具有宽广的动态范围（超过五个数量级）和极高的灵敏度，可同时检测样本中的低表达和高表达目标。安捷伦的芯片一贯灵活，充分支持研究者设计与其实验相关的各种定制芯片。

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qPCR分析

: z5 ?: D9 K2 c9 ~提到qPCR的分析，我们当然不能忘了金标准的TaqMan Assay。TaqMan? Non-coding RNA Assays是基于久经考验的TaqMan?分析技术，借助现有TaqMan? Gene Expression Assay的设计渠道，来生成分析，以便准确检测非编码RNA靶点。据介绍，Life Tech提供近25,000个TaqMan Assay，特异针对人、小鼠和大鼠的lncRNA目标。
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Life Tech在lncRNA分析的整个流程提供了丰富的产品，从RNA分离到逆转录，从qPCR到数据分析，详见下图。欢迎索取详细资料。



, {. ]) W0 Q- D5 g4 }' M% dlncRNA的功能分析
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6 H  Q) y6 h8 q& }# O$ p; W就lncRNA的功能分析而言，siRNA是大家常用的工具。不过，Exiqon公司提供了一种更先进的工具。LNA? longRNA GapmeR提供了RNase H介导的lncRNA的高效沉默。它的结构中间为一段DNA分子，两侧由LNA修饰的核苷酸封闭。这种LNA碱基的设计增加了寡核苷酸与靶标的亲和性及其本身对核酸酶降解作用的抵抗性，而中间DNA gap结构的作用却恰恰相反，它激发了RNase H的活性，在DNA与靶RNA结合的部位进行剪切。

与传统的siRNA方法相比，单链的反义寡核苷酸（ASOs）除了能够激发RNase H的活性，脱靶效应也更低（因为没有“过客链”（passenger strand））。这种ASOs也能有效地作用于核内的靶RNA，这样就更有利于对核内lncRNA的功能进行研究。

新一代测序

1 R5 p: Z3 m8 r( f$ T在lncRNA的发现阶段，新一代测序平台无疑是人们最得力的助手，而许多新的发现也正是来源于此。如今，人们正利用Illumina、Life Tech和454的新一代测序技术来研究非编码RNA表达。

. S0 a- V1 D7 M' c9 I0 y* t斯坦福大学医学院的研究人员曾利用高通量测序技术，对64个肿瘤样品进行了已知lncRNA和新颖的基因间转录本的研究。他们首次绘制出多个癌症的lncRNA表达谱，并鉴定出多个在不同癌症类型中差异表达的区域，它们有望成为重要的癌症标志物。

% s- c8 O) p- u# g& C若实验室没有高通量测序仪，也不用着急。华大科技最近推出了长链非编码RNA测序服务。lncRNA-Seq使用特定方法降低样本中rRNA的丰度，然后对富集到的RNA进行文库构建、测序及分析，从而快速、全面、准确地获得与特定生物学过程（例如发育、疾病等）相关的lncRNA信息。该方法可以更加高效地获取lncRNA序列，且突破了常规lncRNA芯片检测技术的使用范围限制。更值得注意的是，lncRNA-Seq可以助力科学家对新的lncRNA进行预测及分析。
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  }1 u* z6 t4 Z) p  [( F6 S( ?8 e/ ?lncRNA这个全新的世界正等待着我们去探索。尽管我们对它的了解有限，工具也有限，但正是如此，才有可能抢先占领制高点，发表漂亮的文章。