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( C5 J, _/ h W& e; R* }; G- S7 E0 V自从哈佛大学遗传学家 George Church 和 454 Life Sciences 公司 Jonathan Rothberg 掀起下一代测序 NGS 的革命以来,已经过去了将近十年。毫不夸张地说,这段时间以来 NGS 技术已经发生了翻天覆地的变化,在测序通量突飞猛进的同时,测序成本直线下降。 9 X4 {. I" `& q
想当年 454 Life Sciences 公司测序 580-kb 的细菌基因组,需要四小时的工作循环。而今年一月份 Illumina 公司发布的 HiSeq X? Ten 测序系统,能够以千元成本测序完整的人类基因组,最多每天能测序 600 billion bp。
# k2 y3 Y3 P7 y6 F3 D8 o- W 如今,下一代测序技术给生命科学领域带来了彻底的改变。而 NGS 领域本身也在经历着某种意义上的变革。正因如此,基因组学 Archon X 奖(Archon Genomics X Prize)不得不于 2013 年 8 月宣布取消,因为测序成本的直线下降已经使竞赛变得毫无意义。Church 的团队是该竞赛仅有的两只报名队伍之一,他认为参赛者们是否能够完成竞赛任务还很难预料。但无论如何,既然竞赛已经启动,总得让人家比完吧。 + u7 d, q! ^' o
言归正传,下一代测序领域的 2013 年既忙碌又喧嚣,在开年之际让我们对这一领域发生的最新进展做个小结吧。 4 F8 d" ?8 f! h' L( X
454 Life Sciences 5 D7 ~$ W% c3 r4 o1 q! a
2013 年 10 月, 454 Life Sciences 宣布将于 2016 年中旬逐步淘汰其焦磷酸测序仪器,GS Junior 和 GS FLX+。据该公司介绍,从扩展性和成本角度看,454 平台作为首个商业化的 NGS 系统已经基本上走到尽头,很难再对其进行升级和改良。Roche 的 Beth Button 指出,公司正在寻求新的测序合作伙伴。2013 年 9 月,该公司宣布与昔日的竞争对手 Pacific Biosciences 合作,拟基于 PacBio 公司的SMRT技术进行诊断产品的开发。 $ K* D7 W9 U' m# t. Z
Illumina
/ E/ h9 L. M; B' _ f+ ^9 I% Z8 k 2014 年 1 月 Illumina 公司发布了两个以 Solexa 测序技术为基础的新测序平台,HiSeq X Ten 和 NextSeq? 500。
9 ~- C9 a V2 C0 c* C 据该公司介绍,定 价$250,000 的台式 NextSeq 500 兼具了样品制备和测序功能。“它按钮式的操作,可以在许多常见测序应用之间切换。该系统能够在一天内测序整个人类基因组和多达 16 个外显子组。”NextSeq 500 运行 75 个测序循环只需 12 小时。
5 Q3 b3 ]. `: J; LHiSeqX Ten 系统以 10 台仪器为单位销售,据称可以实现千元成本的人类基因组测序。该系统现定价 1000 万美元,能够在三天时间内生成 1.8 terabases 的数据,相当于每天约 600 Gb,比 HiSeq 2500 强十倍。
& p7 q! O5 u" M+ x3 g0 M 华盛顿大学的 Elaine Mardis 表示,HiSeqX Ten 系统针对的应该是提供人类基因组测序的服务产业,因为很少有研究机构能用到如此高的通量。“要想实现千元成本,就需要正确的样本量,”她说。当然,高通量还意味着更为复杂的数据分析。
8 F! J. Z' |' X/ N7 e; n' ]Mardis 的团队曾作过计算,为了跟上 HiSeqX Ten 他们可能需要花费 800 万美元在信息学设施上。此外,实现千元成本意味着每年需要测序 18,000 到 20,000 个基因组。“我要测序许多肿瘤基因组,”她说。“但数量还远远不够。”
, W- f8 p- c' F$ v8 zLife Technologies
0 O% Z# ]6 i5 ~6 P3 n4 t7 O$ Y6 |0 G已被 Thermo Fisher 收购的 Life Technologies 拥有两款 NGS 平台, SOLiD 和 Ion Torrent 。据 Thermo 的 Andy Felton 介绍,公司已经将工作的重心放在后者身上。“绝大多数研发工作已经转移到 Ion 上,”他说。
; m h' {2 v7 ~! V7 d 目前的 Ion PGM 系统可使用最新的 Ion 318 芯片,产出多达 6 million 400bp 的读取,也就是说 4 小时运行的产量能达到 2 Gb。而新 Ion Proton? 使用 Ion PI? 芯片,能够产出 80 million 200 bp 的读取,即每次运行产量达到 10 Gb 至 14 Gb。 6 W9 J, n9 c/ H4 L8 c, z& Q- p0 k' r$ K
据介绍,今年公司将会推出用于转录组测序的新 Ion PII 芯片,每张这样的芯片可产出 300 million 100bp 的读取,随着系统改良甚至可能达到 200bp。 0 {7 P3 K. k" D/ G3 k' r* l
此外, Life Technologies 公司正在研发一种新的聚合酶,Hi-Q。据 Felton 介绍,Hi-Q 能“显著提高精确性”,减少 90% 的插入/缺失误差。这种酶将于今年的中旬实现全面商业化。 ' W, j, L5 j# G5 _
Pacific Biosciences ! X: G$ A0 O* t2 G
Pacific Biosciences 公司以长读取的下一代测序技术著称。据该公司的创始人 Steve Turner 介绍,在新测序化学 P5-C3 的帮助下,如今 PacificBio 的测序读长已经达到了 8.5kb。P5-C3“提供了一个保护性的支架”,可以阻止酶和荧光团之间发生身体接触,避免酶受到潜在的光学损伤。 0 ]" V. G2 R" O" l/ G
“我们已经很大程度上减少了系统中的光学损伤,我们相信现在测序读长受到的限制,只来自于样品本身,” Turner 说。 样品本身的限制是指,读长越长就越难生成不含损伤位点或缺口的测序模板,而这样的缺口会导致测序过早中止。 ) V9 y$ Y1 A' q: ~" F
目前 PacBio ? RS II 和 SMRT Cell 系统,每次运行可产出 50,000 个读取(约 400 million bp)。这一数字会在接下来的一年中继续增涨, Turner 说。“我们预计在 2014 年内,令测序读长再增加50%,并于 2015 年达到 20,000bp。” " Z' J: Q3 ?' _% `2 i& t# e
最近研究人员发表文章向人们展示,在新装配方法 HGAP 的帮助下(hierarchical genome-assembly process),可以实现只利用 PacBio 化学法对真核基因组进行从头装配。一月份,该公司公布了对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)进行的完整二倍体基因组装配,生成了长达 24.6 Mb 的重叠群(contigs), N50 值为 15.2 Mb( N50 值反映了重叠群的长度)。就在上周, PacBio 公司又公布了一个 54x 覆盖度的单倍体人类基因组装配,生成了“3.25 Gb 的基因组装配,重叠群 N50 值为 4.38 Mb,其中最长的重叠群达到 44 Mb。” % O, P9 e' D7 O* I
Oxford Nanopore . E% ^ x( O1 U7 k8 T9 h
Oxford Nanopore 公司无疑是纳米孔测序的领导者,这一技术也被称为第三代测序。该公司 2013 年 10 月份宣布,将在 2014 年年初推出 USB 大小的 MinION ? 测序仪,为客户提供先期体验(early-access)。 ; q6 B7 y/ g% k3 R. a* u3 E' b
与其他类似先期体验项目不同的是, Oxford Nanopore 公司不会局限于传统的测序中心,而是向广大的个人用户敞开大门。该公司准备在接下来的一周发出邀请。 Q3 V1 D( x/ m9 Z! T2 [( e; ]
Oxford Nanopore 公司强调,不是每个 MinION Access Program(MAP)申请者都会在第一轮受到邀请,而且公司提供的 MinION 数量也可能少于申请者的要求。这些仪器将在六周内进行发送。 ! d8 L# i9 ]/ B) _ e" ?* t
2012 年, Oxford Nanopore 公司在 AGBT 大会上描述了两个测序系统, MinION 就是其中之一,另一个产品是 GridION?。据公司发言人称, MinION 的大小使其更容易受到人们的关注,它的灵活性和测序能力将推动 NGS 进一步迈向普罗大众。 0 x( E( J2 q9 c5 j" o+ i# d
Oxford Nanopore 公司希望通过 MinION Access Program 评估测序系统的实用性、对不同应用的适应性、数据分析、以及公司的物流运输和试剂分配等。这些数据将有助于未来开展的 GridION 先期体验项目,不过该公司还未公布这一项目的具体启动时间。
/ J' U" J, \: l/ d+ S! @广泛的应用前景
* t, x& p2 R: r d, H 在下一代测序技术不断进步的同时,它的应用也越来越广泛。据 Mardis 介绍,下一代测序在临床领域的应用快速增涨。越来越多的研究者选择下一代测序的多基因 panel 对肿瘤进行研究,或者通过外显子测序鉴定潜在的药物靶点。在诊断儿童遗传学疾病时,人们也逐渐抛开了传统的诊断方法,转而使用全外显子组测序。
& `! R; w. Y4 n9 uMardis 补充到, NGS 检测有两大优势,它既可以帮助人们确定治疗方案,也可以为患儿父母评估他们未来子女患同样疾病的风险。实际上 Church 认为,用下一代测序进行(致病基因)携带者筛查,是 NGS 的“杀手锏”。 + l1 X+ ?% N% [: L9 n- ~* o) n( k* Y
“任何考虑使用辅助生殖手段的人…都应当知道精子捐献者是否携带与严重疾病有关的隐性等位基因,”他说。“人们已经发现了数百个能够预测疾病的基因,现在也有不少服务可以对它们进行准确的检测。” 5 |2 {$ i% j6 ]$ D1 [
最近, Church 作为共同作者发表了一项新研究。据他介绍,这是首次发表用 NGS 进行携带者筛查的文章,他们的方法“充分提高了质量并且降低了成本”。研究团队使用padlock探针,在194个细胞系中抽出并测序了15个有临床意义的基因,其中55个细胞系来自于携带上述基因突变的个体。
2 h; }1 }9 L9 J& l 下一代测序的另一个新兴的应用领域是单细胞 RNA 测序。“单细胞 RNA 测序能向我们展示,相同细胞中 RNA 表达的天然随机性,这一点非常吸引人。” Mardis 说。
2 h: R3 R6 ~" @# P+ TChurch 介绍到,他即将发表的一篇文章描述了一种新的测序方案,称为荧光原位测序(fluorescent in situ sequencing)。这一技术将荧光原位杂交和 RNA -Seq结合起来,能够计数并确定不同转录本在组织切片中的空间定位。 ) a' R& ^! W, z# q r9 O
Church 的团队通过荧光原位测序证实,转录本会依据伤口的愈合情况在成纤维细胞中呈不对称分布。 # f- R% s- ~0 y) }5 t) K
这样的数据在十年前简直难以想象。同样,我们也很难想象 NGS 在未来十年又会发生怎样的翻天覆地的变化。 |
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