显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同,可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光(紫外线显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。 & G1 w* M6 N, @$ o0 i! G
—、光学显微镜
% ?* f# w: k& h3 N6 E) _+ L (一)、普通光学显微镜
6 D7 D' t+ N! n 普通生物显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体,为了消除球差和色差,目镜和物镜都由复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定材料和观察方便(图2-1)。
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图2-1 尼康E-600显微镜 ( {6 Z) w6 e4 ^9 P1 C4 h6 H
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率,用公式表示为:
7 {7 m2 ?8 Z* O. [6 H R=0.61λ /N.A. N.A.=nsinα/2
1 N8 p& J) J( G4 Q 式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。 2 ^1 H1 l0 I6 s- L% Y) I8 X
表2-1 及中介质的折射率
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& a4 I# x! E; o$ w+ S- z, G2 x
介质 | , e; C- T* l# \
; }3 r ^& _1 K) g9 n! s# k 空气 |
: H, L9 r" b7 C& a0 B. ]/ f
3 g! S( N: N4 a1 L8 Z. } F' e 水 |
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香柏油 | " }4 V) z# p# @3 n* D) |! E
6 |3 o& J( W ^6 N2 b ] α溴萘 | 7 g G& V. f1 E8 a
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4 M! ?: h9 n6 k. ] 折射率 | q( G3 Y2 Z% o
1 B# v g7 ~, t; e' M 1 | " G9 ^! b, I( j
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1.33 |
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: M6 n( u& n s" E7 F 1.515 | - W% o$ [. a1 |2 E5 J# b3 n1 P( n% ]
- f& T8 J3 L, k6 Z: {' Z$ \ 1.66 |
1 b3 u2 q. U9 c7 N3 N 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。
! a8 o* h- F1 I 普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 3 s# Y6 \* ]; D
(二)、荧光显微镜
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% j, ~$ ~% y0 X* B. B" I5 r) x1 T% X图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜 # H* L# ~+ d8 }4 x
细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 7 S9 g6 t+ Y- ^
" B8 Y' j$ K. ~9 ^+ r图2-3 落射式照明原理 : \ x1 S) U% H
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别:
4 r# z j/ B% T5 T6 e! H" [, n 1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3);
N0 M3 g2 i0 Z) j' ^ 2.光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜; * B% Q- r* `/ C; g/ L1 w8 I
3.有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人目。 " C+ i7 U) g8 t
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图2-4 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自http://www.itg.uiuc.edu
+ M' W0 B; L) m1 y& W5 B (三)、激光共聚焦扫描显微境 " t- h; F. k/ ]% b# K# ?* e
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图2-5 激光共聚焦扫描显微镜 - s, X" C6 F& z) L. f. A Z" i, `
9 S4 T8 w3 [+ Z$ h图2-6 LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自http://www.itg.uiuc.edu
9 |: B+ H |+ _; r' w 激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。 I7 f# {( A4 w5 p+ A3 F8 H6 T9 z
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 ) m, \, o9 I& X7 u) G+ z% ^( J3 ^
(四)、暗视野显微镜
6 J9 y, U' Q5 Q: B, L. N% v 暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。 * e9 v; M" y4 x
( c' x# H {) h& G# @, X图2-7 暗视野照明方式 2 P4 b: e' K% U' r( U& U
(五)、相差显微镜
" w1 j3 ]# S8 ]/ |* J+ ]( t5 e 相差显微镜(phasecontrast microscope,图2-8、9)由P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
: i% i, F C/ d: P0 B; a l* N 相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处: , [4 V$ e2 f- B+ M
1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
G. [0 a: g: ^% h+ R8 Z* L 2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:
( K. |7 P% D. N 1.A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。
' f) E" r4 ] J 2.B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。 " }9 o# O& @" R$ [: R
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图2-8 相差显微镜照明原理 8 T. I1 @. G, o4 w
- ~# d2 f, z7 X* i @- `' v图2-9 一种介壳虫的染色体(PCM照片) * h$ U8 \7 A6 E
(六)、偏光显微镜
9 X9 Y- t% c3 a9 p6 T$ h! X! ] 偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。
1 |% w( p1 r/ ]8 c6 u, f (七)、微分干涉差显微镜 ) B7 O0 S7 q/ v7 ?, O/ |
1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。
: ?% y* K4 z0 K3 t/ n& x DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图2-10)。
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) V2 h& {% s# c图2-10 DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)
2 F3 x6 E8 P0 M( q) W3 \$ W DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 4 v* v. |- v' ^' r. E E9 k
(八)、倒置显微镜
/ Z+ ]1 v# b( n% Q$ J; o: q 组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。
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图2-11 莱卡倒置显微镜 ' Z' q. ~ Q i. ?1 ^+ h8 ~
进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体,从而操作灵活,使用方便。
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