封闭抗体

小丫

第一部分 临床意义
现代生殖免疫学认为，妊娠是成功的半同种移值过程，在母体免疫功能正常时，既保护母体不受外来微生物的侵犯，又对宫内胚胎移值不发生免疫排斥反应，并维持妊娠的继续。自然流产连续发生二次或二次以上者为反复性自然流产（RSA），反复性自然流产的原因比较复杂，而且常为多种因素共同所致。比较明确的病因有：①遗传因素约占4.5%－25% ②内分泌因素约占13%－20% ③生殖器官异常约占12%－15% ④感染因素约占2% ⑤原因不明者约占40%～60.00%，其中80%与免疫因素有关。

- H$ V  G+ F/ Y# C1 m' U9 M在正常孕妇的血清中，存在一种抗配偶淋巴细胞的特异性IgG抗体，既抗丈夫淋巴细胞抗体（Antipatemal lymphocyte antibody， APLA）它可抑制淋巴细胞反应（MLR），封闭母体淋巴细胞对培养的滋养层的细胞毒作用，防止辅助T细胞识别胎儿抗原的抑制物，并可阻止母亲免疫系统对胚胎的攻击。封闭同种抗原刺激的淋巴细胞产生巨噬细胞移动抑制因子（MIF），故称其为封闭抗体（blocking antibodies，BA）。
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封闭抗体是人类白细胞抗原（HLA）、滋养层及淋巴细胞交叉反应抗原（TLX）等刺激母体免疫系统，所产生的一类IgG型抗体。研究认为，孕妇血中的APLA可以表现以下作用：⑴APLA中和同种异体抗原，而不使胎儿受到排斥；⑵抗体直接作用于具有免疫能力的细胞如：CTL细胞、NK细胞等；⑶直接结合到靶细胞的抗原上，从而降低它们对受体细胞参与的免疫反应的敏感性。以往研究认为，反复自然流产的发生与母体缺乏APLA有关，流产次数越多的患者，其体内APLA缺乏的可能性越大。APLA的产生不足，母体对胎儿产生强烈的排斥现象，发生于孕早期可出现反复自然流产，孕晚期可出现妊娠高血压疾病、胎儿宫内生长受限、甚至出现胎死宫内。因此对反复自然流产患者进行APLA检测是非常有必要的。

2 L7 V% U0 a" @3 s" G3 S国内外学者一致认为RSA是由于母体不能识别父方抗原而产生保护性反应所致，临床采用配偶淋巴细胞免疫治疗诱导母体产生同种免疫反应，从而出现APLA及微淋巴细胞毒抗体，使母体免疫系统不易对胎儿产生免疫攻击，使妊娠继续。部分学者认为，RSA与母体存在特异性的流产易感基因或单体有关，这种易感基因或单位可能存在于HLA复合体内或与其紧密连锁。含有易感基因或单体的母体对胚胎抗原呈低反应状态，同样不能产生APLA，使胚胎遭受到母体免疫系统排斥而发生流产。

对于APLA阴性的患者，可有针对性的选用丈夫淋巴细胞主动免疫疗法，因为这些患者的流产次数越多，体内免疫系统紊乱越严重，若没有针对性的有效的免疫于预，她们很难有机会成为母亲。自1981年Taytor和Beer等创立了RSA淋巴细胞主动免疫疗法，经过20余年的临床研究表明，免疫治疗确能有效阻止APLA缺乏性RSA。国内外不同学者对原因不明性反复自然流产患者进行淋巴细胞免疫治疗后，妊娠成功率达到72.73%－86.2%，且未发现对母、儿的副反应，APLA的阳性率明显高于治疗前，而APLA阳性者再次妊娠的成功率明显高于阴性者。

& t) O9 V9 x* b, E4 }7 a根据国内外经验，对于反复性自然流产的患者先进行APLA检查，如果APLA阴性，则采用丈夫淋巴细胞主动免疫疗法。主动免疫原首选丈夫淋巴细胞，或丈夫不宜作为免疫原供者则选用无关的健康个体，抽取供者外周血30ml肝素抗凝，再无菌条件下常规分离提取淋巴细胞，用生理盐水洗涤3次后，调至淋巴细胞浓度为(2~4)×107/ml，细胞悬液量约3ml，用皮内注射的方法，注入女方左右手臂皮内6~8个点。每隔2~3周一次，4次为1个疗程，治疗过程中避孕。疗程结束后2周后复查APLA，如APLA转为阴性，则可计划受孕（包括检测排卵、促排卵、人工授精、试管婴儿等）。如APLA仍为阳性，则需继续注射治疗，直至APLA转为阳性后再考虑受孕。如获妊娠，则马上再进行一个疗程的维持治疗，直至孕16周左右。大量研究证实淋巴细胞免疫治疗RSA有效安全，并且APLA对再次妊娠结局有良好的预示价值。
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反复性自然流产的免疫治疗

& V2 f, U, c/ d2 v/ z) V妊娠早期反复自然流产（RSA）在妇科领域中属常见疾病。RSA的病因比较复杂，主要包括有遗传因素、内分泌紊乱、子宫异常、感染、免疫因素等，其中免疫因素占大多数，达50%~60%。在免疫紊乱的因素中，最常见的一种类型就是同种免疫型，从移值免疫学的角度来看，妊娠是一种半异体免疫移值，来自父亲的一半抗原对母体来说是“异己”，母亲体内的免疫系统就会自动去清除它。但是，绝大多数妇女却能继续正常妊娠至足月，其原因就是因为妊娠以后免疫耐受机制的存在，其中封闭抗体的产生起了重要的作用。如果封闭抗体缺乏，就是导致流产。封闭抗体产生不足的同种免疫性习惯性流产，可以通过淋巴细胞注射进行主动免疫治疗，使体内产生和增强封闭抗体，减少流产的几率。目前这种疗法的治疗成功率达到90%以上。

封闭抗体检测 封闭抗体即抗丈夫淋巴细胞抗体（APLA），反复性自然流产患者免疫治疗前后需要进行封闭抗体检测，方法为抽取患者外周血2ml，分离血清，用ELISA法进行测定（按试剂盒说明书操作，所用试剂为美国进口，北京索奥生物技术有限公司提供），如果APLA阴性，则需要进行免疫治疗。
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4 w6 i. m5 V8 [! w2 l% B免疫治疗方法 主动免疫原首选丈夫淋巴细胞，若丈夫不宜作为免疫原供者（如HbsAg阳性或出差）则选用无关的健康个体，抽取供者外周血30ml肝素抗凝，在无菌条件下常规分离提取淋巴细胞，用生理盐水洗涤3次后，调至淋巴细胞浓度为(2~4)×107/ml，细胞悬液约3ml，用皮内注射的方法，注入女方左右手臂内6~8个点。每隔2~3周一次，4次为一个疗程，治疗过程中避孕。疗程结束2周后复查APLA。阴性者继续进行下一个疗程的免疫治疗，直至APLA转为阳性后再考虑受孕。阳性者鼓励患者在6个月内妊娠，如获妊娠则马上再进行一个疗程的维持治疗，直至孕16周左右。同时嘱患者妊娠后注意休息，避免妊娠早期性生活频繁，解除精神紧张，并注意观察妊娠早期反应。

" P0 N$ f9 W9 `- n* {/ W6 B3 f为保证患者的治疗效果和安全，接受治疗者应具备以下条件：
/ v& n. q& t: G/ U+ y1、  封闭抗体检测为阴性；
* M: p1 d( `: b& P2、  夫妻双方染色体正常；
3、  夫妻双方ABO和Rh血型检查明确；
4、  夫妻双方乙肝表面抗体，丙肝，梅毒和HIV抗体以及TORCH检测正常；
, {# E5 q' w- {3 a$ Z5 d5、  夫妻双方肾功能正常；
/ z7 L: W" F9 ^/ _, }6、  妻子内分泌无异常，免疫球蛋白和甲状腺正常；
7、  妻子生殖道及其他妇科检查正常；
8、  夫妻双方身体健康，无免疫性疾病等。
对于紧急保胎者至少接受肝功能和输血前八项检查。
7 M) t5 ]7 n/ F  {注意：
4 ?. [5 }# U1 d3 m, c1、  治疗应在医生统一计划下进行；
! E7 O2 z5 n* v* q2、  早孕后出现阴道出血等其他先兆流产情况，应及时与医生联系，以便及时补胎；
8 G: n# I, {0 @% n" ^7 X4 |3 K3、  建议早孕后配合中西医安胎；
4、  免疫治疗期间出现不适，要及时联系医生。多数患者首次治疗出现红肿等现象，为免疫反应，治疗数增多会逐渐减弱。
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. X! v! V* r. _" D+ z淋巴细胞免疫治疗操作流程

% H" @* d5 y) U1 M2 q' c& a一、材料、设备与试剂
  v6 n" e# q5 }: m7 E1、  设备：超净工作台、恒温试管架、电动注液器、离心机、生物显微镜、冰箱。
2、材料：50ml注射器、15ml无菌离心管、5ml无菌试管、10ml移液管、Pasteur吸管、载玻片、盖玻片、1ml注射器、酒精灯。
3、试剂：1.077人淋巴细胞分离液、10ml生理盐水。
二、操作流程
1、取10ml移液管用电动注液器吸取人淋巴细胞分离液分别注入15ml无菌离心管，每管4ml,共5管。室温下避光放置1h以上或直接放在恒温试管架上0.5h。待分离液升温至室温待用。
2、抽取丈夫或异体静脉血20ml，用12500U（2ml）肝素抗凝。
3、分别吸取4ml丈夫或异体静脉血沿管壁缓慢加在人淋巴分离液上。注意一定要缓慢加入，以免跟分离液混匀而致分界不清，影响分离效果。
4、离心： 2000rpm离心20min。
5、取一支10ml生理盐水，均等的加入2支5ml试管内待用。
6、洗涤：离心结束后用吸管吸取富含淋巴细胞的白膜层，分别置入已盛有生理盐水的2支试管内,混匀。注意吸取白膜时要轻、稳、准，既要避免吸入过多的红细胞和分离液，又要尽量吸取干净，以免淋巴细胞丢失过多。
/ `2 a3 E4 L, {! d' @: E7、离心：2000rpm离心5min，进行离心洗涤。
8、取一支10ml生理盐水，吸出1ml置于 5ml试管内以备定容。其余平均吸入2支5ml试管内。
9、离心结束后弃上清，取沉淀物置于备好的生理盐水离心管内，混匀，2000rpm离心5min，进行第二次离心洗涤。
10、弃上清，从用于定容的离心管内吸取0.5ml生理盐水分别加入两支离心管内，轻轻吹打均匀后再吸入用于定容的离心管，再次吹打混匀。
: h0 m! Y. t$ v9 ]9 S11、吸取5µl混匀提取液于一洁净的载玻片，盖上22mm×22mm盖玻片。
12、放置1 min，在显微镜下计数，总放大倍数为400倍，据计数结果调整淋巴细胞浓度为（20-40）×106/ml，混匀备用。
13、消毒接受免疫者左右三角肌下沿，皮内注射3-4点。注意注射时要缓慢、匀速推，以防返流。
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' g* v5 H7 p. F: t( q0 a9 h7 ^淋巴细胞主动免疫知情同意书

, K4 Q. `. _$ A8 J+ f7 ^+ N姓名： 病历号：
我们因为流产____次于______年______月______日行夫血淋巴细胞主动免疫治疗。
% ?1 }! s0 w3 t) L) e8 U7 T+ T我们了解到淋巴细胞主动免疫治疗过程
1、淋巴细胞主动免疫治疗可以在女性非经期的任何时间进行，每2～3周进行一次，4次为一个疗程，治疗过程中需避孕。
* |6 }: n5 j8 E1 n& ~( x# X2、淋巴细胞主动免疫治疗1个疗程结束后2周复查封闭抗体，若为阳性即可在下次月经周期妊娠，如果仍为阴性，可继续治疗1～2次，复查封闭抗体阳性后可妊娠。
3 w# m3 _+ y. S$ r  t3、封闭抗体阳性者如怀孕，须立即再进行1个疗程维持治疗，以巩固疗效。
4、封闭抗体阳性后可维持半年左右，若半年内未妊娠，每3月加强治疗1次。
0 v& E) G, ~. g  C. _淋巴细胞主动免疫治疗后可能出现的情况
3 K1 z2 b+ l0 \1、淋巴细胞主动免疫治疗后封闭抗体持续不转阳。
4 j( j) U% ?, B/ S2、封闭抗体转阳后怀孕仍有发生流产的可能。
3、因注射夫血淋巴细胞所产生的其他不良反应。
0 O9 q( j; O9 q免疫治疗前需要完善的各项检查
2 i, U6 E7 [7 X3 s5 \+ Z! k' G/ D女方：肝炎系列（乙肝、丙肝）、梅毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV抗体）检查、肝肾功能、血沉、自身免疫抗体、抗O抗体、类风湿因子
; ~6 N+ L# x. O男方：肝炎系列（乙肝、丙肝）、梅毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体（HIV抗体）检查、肝肾功能、
通过与医生交谈，知道我们有以下权利和义务：
0 Q. g+ g0 X0 k" ~( t8 W1、我们有按自己的意愿随时终止治疗的权利，并承担由自愿终止治疗产生结果的责任。
* Z. f) ?, j% m2 R/ Z" Q7 ^& B$ V2、在符合医学、法规、制度和伦理原则的条件下，我们有与医生讨论治疗方案的权利，同时有遵守医嘱的义务，如果不遵守医嘱，我们将承担由此产生的医疗责任。
3、我们享有隐私保护权利。
4、为对自己、后代、科学技术负责，我们有按规定接受随访的权利和义务。
; j+ t4 j) i3 L6 H5 O5、在符合隐私保密原则的情况下，我们有了解治疗经过的权利。
6、为了维护我们的权益，如对工作人员的工作有异议，我们可采取以下方式：1）与中心主任协商；2）向医患关系协调办公室投诉。
$ y0 {+ F! s- S* y7 }" z0 S: }/ ]医生也详尽地告知了我们该技术有以下风险：
. u: N; Z. |$ d1、部分人经淋巴细胞主动免疫治疗后封闭抗体持续不转阳，若怀孕有再次发生流产的可能。
! M9 m8 y( P  J1 D$ t; `2、封闭抗体转阳后，保胎的成功率约为80%，但仍有20%的机会发生再次流产。
( h8 e$ Y" I' M2 }3、主动免疫治疗后怀孕的妇女与未经治疗的妇女怀孕一样也可能发生：早产、宫外孕、胎儿畸形及胎儿宫内发育迟滞。
4、虽然术前夫妻双方已检查过HIV、RPR、HCV、HBsAg,，但丈夫半年内如有不洁性生活史、吸毒、输血等高危行为，因检测窗口期某些疾病无法检测出，因此可能导致妻子感染相关经体液传播的疾病。
8 C% X7 Q$ ~! N7 w5、  个别人主动免疫后局部反应较重，如瘙痒、红肿、输血反应、过敏反应、发生注射物抗宿主反应及恶化母体潜在的自身免疫性疾病的危险、并有使母亲对胎儿免疫反应增强的可能等。
/ i9 W) Y- m! }" v. {8 o2 N我们夫妻双方对上述内容已充分了解，对免疫治疗所造成的一切不良后果愿意承担全部责任。
丈夫：____________________ ______年______月______日
5 _" k; S0 f) M7 q; o妻子：____________________ ______年______月______日
2 I0 @" r2 l& B/ e- P医生：____________________ ______年______月______日