NK细胞活性测定：同位素法

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一、原理
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! \3 P3 r- {. d* _2 l- L将用同位素3H-TdR标记的靶细胞与淋巴细胞共同培养时，靶细胞可被NK细胞杀伤。同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释放的量与NK细胞活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可反应NK细胞的活性。

' K% D4 H9 f  ]" w二、仪器和材料

液体闪烁仪、多头细胞取集器、二氧化碳培养箱、3H-TdR、RPMI1640 完全培养液、Hank's液（pH7.2～7.4）、YAC-1细胞、Triton X-100
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三、实验步骤
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1、靶细胞的标记
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7 ]8 n* A, U" H' y+ Q; C; I取传代后24h生长良好的YAC-1细胞（存活率>95％）按1×106/mL YAC-1细胞悬液加3H-TdR 10uCi进行标记，于37℃、5％CO2培养箱中培养2h，每30min振荡1次。标记后的细胞用培养液洗涤3次，重悬于培养液中，使细胞浓度为1×105个/mL。
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7 ]4 ~4 E% T0 K; {9 e0 F! i2、脾细胞悬液的制备（效应细胞）
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7 s) A7 W* M7 ~" _: m$ c( U无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗3次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为1×107个/mL。
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/ g/ E0 p5 V2 V5 w3、NK细胞活性测定
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在96孔培养板中每孔加100μL标记的靶细胞，实验孔加100μL效应细胞，空白对照孔加100μL培养液，最大释放孔加100μL  2.5% Triton X-100。每个样品设3个复孔，置5%CO2、37℃培养箱内温育4h，用多头细胞收集器将细胞收集在玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪进行测量。
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1 Y2 E- _; c6 T- o% k$ s+ c按下式计算NK细胞活性：

                               实验孔cpm
  r+ Y* J. L8 K0 s, x( ?4 \3 n6 Q
NK细胞活性（%）=（1－ ──────────────────） ×100%
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                                       空白对照孔cpm － 最大释放孔cpm
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( K% U2 j  [/ I4、数据处理及结果判定
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NK细胞活性需进行数据转换，X＝Sin-1 ，式中P为NK细胞活性，用小数表示。在进行方差分析时，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
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受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。