|
显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。
2 h0 N! w! M# R6 i$ C/ a—、光学显微镜
8 h$ [) J3 ^2 f# z2 R
（一）、普通光学显微镜
9 k! G: Q4 [, I$ N 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便（图2-1）。 ( ?0 I& Y; |. E7 f
9 p7 t; j, D# `& V* Q3 b- b
图2-1 尼康E-600显微镜 / Z g/ g! ?4 ]. }, o
显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： 8 z- K5 R% V+ G4 U* i' L
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2
& m( A$ [' y/ v9 o0 u2 e$ k; i4 ? 式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180˚，所以sina/2的最大值必然小于1。 ' f a$ T& W+ A; @/ _6 h) g
表2-1 及中介质的折射率
3 D5 B2 l, s' [( ~" [
8 C" q* _' p$ a% m0 O, x
% W7 R' L: m0 v
$ N* R9 U) q) l# l4 U6 Y7 h; b6 e0 `0 }: E) [/ l5 Z0 G- B
| , X! B/ i: P, t. U9 H
介质 | . ?$ y% I4 ^( Q% V& |$ r
6 ]: F9 y0 F8 G, s: f7 M
空气 | x0 _) z7 H6 Q
* q9 W1 u( Q: r- o- e" L( G
水 | . K/ \7 u# N/ d, { r4 L m
S# w$ U: j/ q; ~
香柏油 | + S% o0 _5 N7 m$ K" M# e5 A
6 S* t/ U- c/ a" O* [, a5 E t α溴萘 | 5 n9 i; P& e# e) {3 P$ P5 k7 E
$ l" E2 H# J6 \8 y4 E/ q5 q8 m. u|
& w; l, j% J4 v$ y 折射率 |
$ g9 ?# G6 c: S4 B0 p5 `& m
: v- I( [4 u. F; D 1 | % }7 a' \: Z1 V" j+ b# t1 @+ ~
- Q0 ~; ^& g' n2 k+ w: ^+ n, ~5 o
1.33 | 7 U% B: |9 H( _' ?# [" b) v7 S0 r
; u7 ?. ^8 v% M O6 R, ^0 s8 {
1.515 |
" z* I5 K( {4 t# t4 [% Q4 q: o U5 s8 v$ Q/ @
1.66 | * h- J6 q: P$ ]& n4 z
制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 , R3 n/ G5 V4 E6 \3 H$ N$ I. E
普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。
9 z9 _4 M$ t" O" j1 N$ C （二）、荧光显微镜
7 R: J+ O; i( N' `
) }4 m7 g u3 b) ^图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜
! d+ ^ b9 ^) k) s. }4 i5 X 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜（图2-2，3，4）就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
+ Q- a* o6 C2 z
# a; c* j6 x3 K
图2-3 落射式照明原理 7 o- I( ?# ]# h: p5 R. O9 z* R
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：
; Y z+ @( q/ X7 a. `. o/ b 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上（图2-3）； ! }0 ?/ [) ^* `
2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜； 6 z, j8 o# ^+ {# u
3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。 ; m" i2 A6 u' c
1 j; j Q6 ?* Z! |4 B" M
图2-4 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色），图片来自http://www.itg.uiuc.edu
2 G2 F L3 a) b' E2 ~ （三）、激光共聚焦扫描显微境
0 n* N9 o. l1 R/ A R
# R8 X9 T9 ?2 [- k8 J
图2-5 激光共聚焦扫描显微镜 5 L% n) j7 q4 a3 y* v
* L! J0 E1 Y8 K$ P4 I, q8 R' e5 O
图2-6 LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管，图片来自http://www.itg.uiuc.edu
+ p9 X+ _% b( R% r: J8 E 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope，图2-5、6）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
( A( D$ } n9 R 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 $ n$ N) f8 I9 R9 q3 t- n; k( U7 G
（四）、暗视野显微镜 + h; Q7 r; n u+ M: J* b
暗视野显微镜（dark field microscope，图2-7）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
, k, E; o9 Z/ m1 O
3 b& ^4 w4 _! w4 [& i8 k; z: v/ E5 Q A
图2-7 暗视野照明方式 5 g7 M3 j, Z3 S! B
（五）、相差显微镜 2 F/ `3 M5 o" Q& Y6 F; d
相差显微镜（phasecontrast microscope，图2-8、9）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
' i$ B2 i6 F% y 相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：
3 {" P* _" [' x4 q9 o) ]; C 1.环形光阑（annular diaphragm） 位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。
; Z) M7 ]1 p! J0 u! z* \ 2.相位板（annular phaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种： 8 B; H% ` u m4 {
1.A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。 9 K) M% X% ?6 B: U2 x( ]" N, |
2.B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。 8 W7 ~& o0 L: |9 o0 O6 O) T
! n9 Z' F3 j& i! I+ e
图2-8 相差显微镜照明原理 ( H* v) C( Z, C
" A& w& e/ h5 J( E
图2-9 一种介壳虫的染色体（PCM照片）
$ U( C. ^5 l" A: r% {( S- @ （六）、偏光显微镜
+ z$ [% f" A6 z* @7 } 偏光显微镜（polarizing microscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。 ; E! h: l) B$ w8 c
（七）、微分干涉差显微镜 4 f' Z2 A" @1 y* D+ W( B
1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differential interference contrast microscope）。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarki contrast microscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 ) I( @% l e/ A& ^! ~' z% m, U# _
DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕（图2-10）。 ; y. W& J/ c/ Z% `7 x& K
. d/ ], t' M) i9 Z1 P* D
图2-10 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色） + {5 P3 o: z& i
DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。 2 @1 v2 b8 i9 f$ S" ?5 _
（八）、倒置显微镜
9 b1 U- V4 P! M3 G3 D& I 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上（图2-11），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
! q/ \% }. v* X
2 ~' e; z* d# L1 H
图2-11 莱卡倒置显微镜
( {% A' R- C! V% `2 {" P 进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。
1 \+ V& p: |2 |2 \- F( x" v
[此贴子已经被作者于2005-7-4 16:32:31编辑过] | 
发表于 2005-7-4 16:31:11
收藏
楼主
