显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同,可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光(紫外线显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。 - [' M! f8 E7 X! L. T w' q0 |7 ^6 s
—、光学显微镜
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(一)、普通光学显微镜
( n! C4 X1 g) \- L+ }5 y 普通生物显微镜由3部分构成,即:①照明系统,包括光源和聚光器;②光学放大系统,由物镜和目镜组成,是显微镜的主体,为了消除球差和色差,目镜和物镜都由复杂的透镜组构成;③机械装置,用于固定材料和观察方便(图2-1)。
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6 x- c0 L2 V+ E% P x, q图2-1 尼康E-600显微镜
4 T1 Y0 @' I9 W8 m+ t" i 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数,还与显微镜的分辨力(resolution)有关,分辨力是指显微镜(或人的眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔的能力,分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率,用公式表示为:
) Q8 U# W+ B+ A R=0.61λ /N.A. N.A.=nsinα/2 ) {9 B0 y* Y$ u }
式中:n=介质折射率;α=镜口角(标本对物镜镜口的张角),N.A.=镜口率(numeric aperture)。镜口角总是要小于180˚,所以sina/2的最大值必然小于1。 . E9 K0 l4 s. O' }
表2-1 及中介质的折射率 - \% }1 T1 W: C4 _7 H9 b1 t
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5 q+ h2 U6 M) }$ o+ A% ]; N, s, a
& n* B/ J9 {7 ~& y# A3 t( u8 x7 J+ `+ z
, Q8 w4 H4 i0 b5 h' ]7 U/ l 介质 | $ v/ }( H. C( U6 X7 Z/ }
/ Q* ?' Z* [4 q. f; e 空气 | 1 |, E% H& w$ P
+ r- @$ J0 u7 q4 ?$ W 水 | 2 `. U$ G1 h5 L7 N9 q
. v/ L4 y/ ?. f) F( N, K 香柏油 |
p0 H; P6 v4 ^& h0 m+ v
. X$ p3 R- k* W+ ]' d α溴萘 |
8 A0 K& c" Y) p$ B" T2 ^* B- j4 j- }) j) u8 R6 Y) A
" M$ B f& C) K; B: q 折射率 |
" `8 }/ t" z) B5 ~* l) G5 B% z# x! `( _% i2 w9 _* E
1 | 0 G4 i3 W) K4 N' M
) o( W5 f0 U4 [) a6 S6 T; r4 q 1.33 | 0 l# W- z( @" W9 `$ t
; x' F* w8 {0 A 1.515 |
9 B M2 Q3 P- c0 H, w) l) g3 y- c# y8 o8 t
1.66 |
r8 N& R% U1 `( h2 N 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78,所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说,介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95;油镜头用香柏油为介质,镜口率可接近1.5。 4 H( f% {. |* m
普通光线的波长为400~700nm,因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm,人眼的分辨力是0.2mm,所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。 . Z/ I Z0 C6 y5 _$ W+ N7 R S
(二)、荧光显微镜
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+ c0 T' }, w8 M( p图2-2 尼康E800荧光DIC显微镜 ' p& Y3 C1 E% D$ T$ q: @, T
细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光,荧光显微镜(图2-2,3,4)就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。
6 Z& E- Y T" t) e
8 g: _" F' P: z: K2 a图2-3 落射式照明原理 ( Y5 f' }& D' g, W( A; h# ^% \# j+ J
荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别: 3 y# C5 E. G8 x5 ]
1.照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上(图2-3);
$ }2 E) z1 I/ \, |" O$ K 2.光源为紫外光,波长较短,分辨力高于普通显微镜; {* m; g# H) O1 Q5 y6 u8 b* B$ l. f4 g# g
3.有两个特殊的滤光片,光源前的用以滤除可见光,目镜和物镜之间的用于滤除紫外线,用以保护人目。 4 M* T: k& w8 `+ L
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图2-4 荧光显微镜照片(微管呈绿色、微丝红色、核蓝色),图片来自http://www.itg.uiuc.edu
" W0 G6 C2 y4 Y; r+ Y* a7 c (三)、激光共聚焦扫描显微境
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图2-5 激光共聚焦扫描显微镜 5 ~2 M2 h3 t7 h0 A2 {2 f! Q
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图2-6 LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管,图片来自http://www.itg.uiuc.edu
2 R' i7 F4 S4 k/ Y4 ~1 m 激光共聚焦扫描显微镜(laser confocal scanning microscope,图2-5、6)用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,扫描的激光与荧光收集共用一个物镜,物镜的焦点即扫描激光的聚焦点,也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短,光束很细,所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力,大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦,扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时,就可以获得样品不同深度层次的图像,这些图像信息都储于计算机内,通过计算机分析和模拟,就能显示细胞样品的立体结构。
4 Z& u; ~$ p( O# F 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态,也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 # e* I; ^" t2 J( Y. e) G, G
(四)、暗视野显微镜 % M% G" Z# p0 z1 ~8 l5 O8 Z0 `
暗视野显微镜(dark field microscope,图2-7)的聚光镜中央有当光片,使照明光线不直接进人物镜,只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜,因而视野的背景是黑的,物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4~200nm的微粒子,分辨率可比普通显微镜高50倍。 0 S. J+ q+ k+ F P4 |
, j4 S2 d) k1 f/ B6 A- j图2-7 暗视野照明方式 ( Z2 o# H# V8 v' y$ X+ V1 k1 k
(五)、相差显微镜 4 A% s1 D8 ^, i3 U& Q0 D. N
相差显微镜(phasecontrast microscope,图2-8、9)由P.Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
, u( B/ }1 v3 T3 f) {& H# J8 a 相差显微镜的基本原理是,把透过标本的可见光的光程差变成振幅差,从而提高了各种结构间的对比度,使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射,偏离了原来的光路,同时被延迟了1/4λ(波长),如果再增加或减少1/4λ,则光程差变为1/2λ,两束光合轴后干涉加强,振幅增大或减下,提高反差。在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:
3 ?/ U6 T% K" B2 l8 { 1.环形光阑(annular diaphragm) 位于光源与聚光器之间,作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上。
+ A1 b- E7 y5 d! R7 m' r 2.相位板(annular phaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁的相位板,可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种:
2 I% q( [- }% M# M; r& S6 O 1.A+相板:将直射光推迟1/4λ,两组光波合轴后光波相加,振幅加大,标本结构比周围介质更加变亮,形成亮反差(或称负反差)。
7 C/ T) |! K( E" s6 X8 B" P 2.B+相板:将衍射光推迟1/4λ,两组光线合轴后光波相减,振幅变小,形成暗反差(或称正反差),结构比周围介质更加变暗。
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图2-8 相差显微镜照明原理
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图2-9 一种介壳虫的染色体(PCM照片)
3 o+ B/ V- Z8 Q7 V2 Z) u (六)、偏光显微镜 ) d v. T) S1 e
偏光显微镜(polarizing microscope)用于检测具有双折射性的物质,如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。和普通显微镜不同的是:其光源前有偏振片(起偏器),使进入显微镜的光线为偏振光,镜筒中有检偏器(一个偏振方向与起偏器垂直的的起偏器),这种显微镜的载物台是可以旋转的,当载物台上放入单折射的物质时,无论如何旋转载物台,由于两个偏振片是垂直的,显微镜里看不到光线,而放入双折射性物质时,由于光线通过这类物质时发生偏转,因此旋转载物台便能检测到这种物体。 1 {: i" A$ g; G2 Q& D2 B; w. s
(七)、微分干涉差显微镜 ! a6 d& t" \2 b9 Z' r
1952年,Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope)。DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜(Nomarki contrast microscope),其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比,其标本可略厚一点,折射率差别更大,故影像的立体感更强。
. p9 g. y) {+ `, } DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜,技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光,有四个特殊的光学组件:偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。偏振器直接装在聚光系统的前面,使光线发生线性偏振。在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜,即DIC棱镜,此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光(x和y),二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致,在穿过标本相邻的区域后,由于标本的厚度和折射率不同,引起了两束光发生了光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜,即DIC滑行器,它把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面(x和y)仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置,即检偏器。在光束形成目镜DIC影像之前,检偏器与偏光器的方向成直角。检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光,从而使二者发生干涉。x和y波的光程差决定着透光的多少。光程差值为0时,没有光穿过检偏器;光程差值等于波长一半时,穿过的光达到最大值。于是在灰色的背景上,标本结构呈现出亮暗差。为了使影像的反差达到最佳状态,可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差,光程差可改变影像的亮度。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象,通常是一侧亮,而另一侧暗,这便造成了标本的人为三维立体感,类似大理石上的浮雕(图2-10)。
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图2-10 DIC显微镜下的硅藻(伪彩色)
& K) x9 G9 X- X& R: ?/ `* H DIC显微镜使细胞的结构,特别是一些较大的细胞器,如核、线粒体等,立体感特别强,适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。
& Q7 O" A# h. f (八)、倒置显微镜
]" o2 O2 K0 g- G 组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上(图2-11),用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。 ! S+ J9 `- a: C. Y. y
! X5 {# ^# B6 Q5 g( u) `. e; \图2-11 莱卡倒置显微镜
% g6 B2 S% e: L* t 进入20世纪80年代以来,光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展,其发展趋势主要表现在,注重实用性和多功能方面的改进。在装配设计上趋于采用组合方式,集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体,从而操作灵活,使用方便。 " V+ I% ~; _9 D6 b4 x& ] Z, z
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