精子的玻璃化冷冻

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    玻璃化冷冻是指细胞及其保护剂溶液以足够快的降温速度，从液相直接固化为完全的玻璃态，并以这种玻璃态在低温下长期贮存的技术。在此过程中，无冰晶的形成，液体由液相转变成一种玻璃状的固体状态，避免了冰晶对细胞的物理化学损伤，可获得较传统冷冻方法更好的冷冻效果。
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一、玻璃化冷冻技术的主要影响因素
玻璃化冷冻技术的诸多变量因素，极大地影响精子冷冻效果和冻融后的存活率，这些因素包括：冷冻保护剂的类型和浓度、玻璃化冷冻液的作用温度、精子投入液氮前与保护剂的接触时间、玻璃化冷冻时使用的冷冻工具、精子本身的质量等，其中，冷冻保护剂和冷冻降温速度是影响精子玻璃化冷冻效果的主要因素。
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二、玻璃化冷冻原理
4 c  F; a( W5 d: o" f1 t2 c 将精子置于高浓度保护剂中急速降温，仅高浓度冷冻保护剂在冷冻过程中固化，形成无结构的玻璃态，由于其质点不规则排列，能始终保持精子细胞内外溶液中的水分子和离子分布，使跨膜物质的浓度和渗透压差别不大，从而避免了细胞内冰晶的产生对精子造成的机械性损伤，同时也消除了细胞外因冰晶形成而对精子造成的理化损伤。采用玻璃化冷冻方法，可将精子暴露在0℃左右的时间缩短至几毫秒，提高了冷冻速率，减少了冷冻损伤。
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4 i" D6 i- L4 z' m5 ?- [3 a. d 三、冷冻保护剂
玻璃化冷冻所需的高浓度保护剂，其浓度可高达8mol/L，易使精子发生毒性效应和渗透性休克，因此，冷冻保护剂的选择及优化是玻璃化冷冻技术应用的关键。
5 U1 |+ m8 d! ?1 ~4 E) {- o7 r较常用的冷冻保护剂有两种：
（1）渗透性保护剂：二甲亚砜、乙二醇（EG）、1，2-丙二醇（PROH）等；
（2）非渗透性保护剂：蔗糖、海藻糖、聚蔗糖（Ficoll）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。渗透性保护剂的主要作用是透过细胞膜，取代细胞内蛋白、DNA和其他成分中的水分，使细胞内冰点降低，减少或避免细胞内冰晶的形成；非渗透性保护剂通过渗透效应促进细胞缩水，稳定细胞膜，降低达到玻璃化本身所需的冷冻保护剂用量，减少玻璃化溶液的毒性。 在玻璃化冷冻过程中，要实现玻璃化，途径之一是提高冷冻保护剂的浓度，但冷冻保护剂浓度的提高又会对精子产生较大毒性，因此，将渗透性、非渗透性保护剂合理化使用，可降低单一保护剂的浓度，减少毒性。
' m+ D5 r$ P8 Y: Q, i. I4 R3 P在玻璃化冷冻保护剂中，对渗透性保护剂的选择，主要是考虑他的毒性和渗透性。乙二醇是目前普遍认同的毒性低、渗透性快的保护剂。一般情况下，玻璃化保护剂中含有渗透性保护剂的浓度大于30%，非渗透性保护剂（如蔗糖）的浓度通常为0.1～1mol/L，例如用15%EG和15%DMSO添加0.6mol/L的蔗糖作为玻璃化冷冻保护剂，冷冻人囊胚，可取得较理想的效果。

四、玻璃化冷冻速率和冷冻载体
提高冷冻速率，迅速通过冰晶形成温度区是实现玻璃化的另一重要途径，-15～-80℃是冷冻样本凝固点温度和玻璃化转变温度之间的区域，在此温度区域内，冰晶产生并迅速增大，以足够快的降温速率通过此阶段，可使液相直接转变为固相，达到玻璃化状态。另外，较高的降温速率能减少精子与高浓度冷冻保护剂接触的时间，降低冷冻保护剂的毒性作用。目前提高降温速度的策略是减少标本体积，增加标本与液氮的作用面积。将冷冻标本与液氮直接、快速接触，可弱化气态氮的热隔绝作用，加快热交换过程，以达到提高冷冻速率的目的。由于玻璃化冷冻需较高的降温速率，而传统的冷冻载体如冻存管、麦管限制了降温速率，因此，目前一般采用开放式冷冻载体，如冷冻环、冷冻薄膜等。运用冷冻环表面张力，精子附在环的表面，直接投入到液氮中，可使降温速率从传统麦管的2500℃/min提高到20 000℃/min，可获得较好的冷冻效果。
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$ o2 m- p  U( k3 W 五、玻璃化冷冻面临的问题
/ c7 K1 q8 X: A' |7 M5 G7 ], O 1.安全性问题：在玻璃化冷冻过程中，由于考虑冷冻速率的问题，大多采用开放性冷冻载体，虽然达到了提高冷冻速率的目的，但精子与液氮直接接触，潜在的微生物污染及精液之间相互污染问题不容忽视。
2.冷冻体积的问题：由于玻璃化冷冻过程中需提高降温速率，故精子冷冻体积受到极大限制，冷冻体积过大，则降温速率达不到玻璃化冷冻要求，且降温幅度不均匀，容易形成冰晶。
& }9 a4 U3 G! H3.降温速率问题：玻璃化冷冻时要求冷冻速率达20 000℃/min，但目前所使用的冷冻设备无法达到如此高的冷冻速率，只能将标本直接投入液氮。但研究表明，只要降温速率达到足以阻止冰晶产生的水平，那么他的作用即是次要的。例如以150～2500℃/min的降温速率玻璃化冷冻小鼠胚胎与20 000℃/min玻璃化冷冻时所获得的存活率无显著性差异，目前认为，以200℃/min的降温速率进行玻璃化冷冻即可获得较理想的复苏率。
4.复温时渗透性问题：由于玻璃化保护剂为高浓度保护剂，复温时，精子对水的渗透性高于对保护剂的渗透性，在保护剂尚未完全渗出细胞的情况下，大量水的进入引起精子顶体过度膨胀、破裂，造成渗透性休克。为了避免复温过程中的损伤，可使用非渗透性物质蔗糖，以维持细胞外液较高的渗透压，以抵抗大量水分子快速进入细胞内而引起的细胞渗透性死亡。

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